ДОСЛІДЖЕННЯ У ПОРІВНЯЛЬНОМУ АСПЕКТІ КРІОЗАХИСНОЇ ДІЇ КРІОКОНСЕРВАНТІВ НА ОСНОВІ ГЛІЦЕРИНУ В КОМБІНАЦІЇ З ПОЛІВІНІЛОВИМ СПИРТОМ РІЗНИХ МОЛЕКУЛЯРНИХ МАС ПРИ ШВИДКОМУ ТА ПОВІЛЬНОМУ ОХОЛОДЖЕНІ ДОНОРСЬКОЇ КРОВІ ЛЮДИНИ

Гвоздюк Я.В. Компанієць А.М.

БІОЛОГІЯ

Наукова стаття

. Формування та зростання кристалів льоду як в біологічній клітині так і поза її межами створює серйозну проблему при розробці способів і технологій кріоконсервування біологічних об’єктів для подальшого використання. Тому протягом декількох років проблема з пошуку та використання сполуки, здатної створювати вплив на процеси льодоутворення, особливо – на процес рекристалізації, наразі активно досліджуються в наукових закладах різних країн світу. Однією з важливих причин загибелі клітин є рекристалізація льоду на етапі відігріву. Пригнічення рекристалізаційної активності є бажаним ефектом який може значно покращити збереженість кріоконсервованого матеріалу. На сьогоднішній день головною проблемою є розробка ефективних засобів кріозахисту, нових кріоконсервантів які матимуть посилену дію на процеси пригнічення рекристалізації льоду, що в свою чергу буде сприяти покращенню кріозбереженності не тільки клітин а й тканин і органів людини. Проте існує низка важливих перешкод з якими дослідники стикнулися в практиці кріоконсервування: це дуже мала кількість сполук, які можна отримати з природних ресурсів, складність або неможливість повного хімічного синтезу аналогів; суперечливі данні щодо ефективності використання цих сполук при кріоконсервуванні біоматеріалу; цитотоксичність та імуногенність природних антифризних білків. У зв’язку з цими перешкодами в останні роки дослідники звертають свою увагу на синтетичні сполуки, яким теж подібно природним притаманна специфічна антирекристалізаційна активність без побічних ефектів. Вирішенням поставленої задачі є розробка кріоконсервантів, в яких поряд з традиційними кріопротекторами будуть використовуватися синтетичні сполуки-антифризи, яким притаманна специфічна антирекристалізаційна активність. З переліку цих сполук увага дослідників прикута до синтетичного полімеру – полівініловий спирт (ПВС). Метою нашого дослідження було дослідити властивості ПВС різних молекулярних мас як активного інгібітора рекристалізації льоду та рівень збереженості еритроцитів в процесі повільного та швидкого заморожуваннявідігріву в кріозахисних середовищах на основі стандартного кріопретектора гліцерину різних концентрацій. Об’єкт і методи дослідження. Об’єктом дослідження був еритроконцентрат, отриманий з донорської крові людини групи А(ІІ), заготовленої на гемоконсерванті «Глюгіцир». Еритроконцентрат отримували центрифугуванням консервованої донорської крові при 1250 g протягом 25 хв. Отриманні данні розраховували за наступними показниками: концентрація вільного гемоглобіну в надосадовій рідині та загального гемоглобіну клітинної суспензії, визначали гемоглобінціанідним методом за допомогою набору «Гемоглобін СпЛ 200» (Україна) та спектрофотометру КФК‑3–01 «ЗОМЗ» (Росія) довжина хвилі 540–545 нм., показник гематокриту – визначали на центрифузі СМ‑70, процент гемолізу еритроцитів в надосаді розраховували за формулою наведеною в роботі Huggins CE. (Prevention of hemolysis of large volumes of red blood cells slowly frozen and thawed in the presence of dimethylsulfoxide). Статистичну обробку результатів проводили з використанням критерію Манна-Уітні для малих вибірок з використанням програмного пакету «Statistica». Результати. В результаті проведеного порівняльного дослідження кріозахисних середовищ різного складу кріопротекторів з розчинами полівінілового спирту при швидкому методі заморожування клітин крові зокрема (еритроцитів) шляхом занурення зразків до рідкого азоту. Встановлено, що після заморожування-відігріву еритроцитів у багатокомпонентних розчинах на основі гліцерину в комбінації з ПВС м. м. 9 і 31 кДа спостерігається тенденція до підвищення збереженості еритроцитів за результатами гемолізу у порівнянні з дією 20 %, 30 % і 40 %-х монорозчинів гліцерину.

еритроцити, кріоконсервація, рекристалізація, полівініловий спирт, гліцерин.

1. Pegg DE. Principles of Cryopreservation. Methods Molecular Biology. 2015;1257:3–19. DOI: https://doi.org/10.1007/ 978–1–4939–219–5-1.
2. Valeri CR, Ragno G. The effect of storage of fresh frozen plasma at –80 C for as long as 14 years on plasma clotting proteins. Transfusion. 2005;45:1829–1830. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1537–2995.2005.00614.
3. Fuller BJ. Cryoprotectants: the essential antifreezes to protect life in the frozen state. Cryo Letters. 2004;25(6):375–388.
4. Sputtek A, Kuehnl P, Rowe AW. Cryopreservation of erythrocytes, thrombocytes and lymphocytes. Transfus. Med. Hemother. 2007;34(4):262–267.
5. Naabel AHT, Yubyeol J, Il-Jeoung Y. Use polyvinyl alcohol as a chemically defined compound in egg yolk-free extender for dog sperm cryopreservation. Reprod Domest Amin. 2019;54(11):1459–1458. DOI: https://doi.org/10.1111/rda.13547.
6. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am.J. Physiol. 1984;247:125–142. DOI: https://doi.org/10.1152/ ajpcell.1984.247. 3.C 125
7. Fowler A, Toner M. Cryo-injury and biopreservatio. Ann. NY Acad. Sci. 2005;1066:119–135. DOI: https://doi.org/10.1196/ annals.1363.010.
8. Jin B, Kusanagi K, Ueda M. Formation of extracellular and intracellular ice during warming of vitrified mouse morulae and its effect on embryo survival Cryobiology. 2008;56:233–240. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cryobiol. 2008.03.004
9. Congton T, Notman R, Gibson MI. Antifreeze (glyco)protein mimetic behavior of poly(vinyl alcogol): detailed structure ice recrystallization inhibition activity study. Biomacromolecules. 2013;14(5):1578–1586. DOI: https://doi.org/10.1021/bm400217j.
10. Beloys AM, Hryshchenko VY. Kryobyolohyya. Kyev: Naukova dumka; 1994. 431 s. [in Ukrainian].
11. Muraoka M, Ohtake M, Yamamoto Y. Kinetic inhibition effect of Type I and III antifreeze proteins on unidirectional tetrahydrofuran hydrate crystal growth. RSC Advances. 2019;9(20):1530–1537.
12. Kristiansen E, Zachariassen KE. The mechanism by which fish antifreeze proteins cause thermal hysteresis. Cryobiology. 2005;51(3):262–280. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2005.07.007
13. Pertaya N, Marshall BCh, Celik Y. Direct visualization of spruce budworm antifreeze protein interacting with ice crystals: basal plane affinity confers hyperactivity. Biophys J. 2008;95(1):333–341. DOI: https://doi.org/10.1529/ biophysj.107.125328
14. De Vries AL, Wohlschlag DE. Freezing resistance in some Antarctic fishes. Science. 1969;163(3871):1073–1075. DOI: https://doi.org/10.1126/science. 163.3871.1073.
15. Carpenter JF, Hansen TN. Antifreeze protein modulates cell survival during cryopreservation: mediation through influence on ice crystal grouth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1992;89:8953–8957. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.89.19. 8953.
16. Tachibana Y, Fletcher GL, Fujitani N. Antifreeze glycoproteins: elucidation of the structural motifs that are essential for antifreeze activity. Angew. Chem., Int Ed. 2004;43:856–862. DOI: https://doi.org/10.1002/ange. 200353110
17. Peltier R, Brimble MA, Wojnar J M. Synthesis and antifreeze activity of fish antifreeze glycoproteins and their analogues. Chem. Sci. 2010;1:538–551.
18. Wilkinson BL, Stone RS, Capicciotti CJ. Total Synthesis of Homogeneous Antifreeze Glycopeptides and Glycoproteins. Angew. Chem., Int. Ed. 2012;1:3606–3610. DOI: https://doi.org/10.1007/s00726–016–2368-z.
19. Koshimoto C, Mazur P. Effect of warming rate, temperature and antifreeze proteins on the survival of mouse spermatozoa frozen at an optimal rate. Cryobiology. 2002;45:49–59. DOI: https://doi.org/10.1016/s0011–2240(02) 00105–0.
20. Gibson МJ, Barker CA, Spains SG. Inhibition of crystal growth by synthetic glycopolymers: implication for the rational design of antifreeze glycoprotein mimics. Biomacromolecules. 2009;10:328–333. DOI: https://doi.org/10. 1021/bm801069x.
21. Matsumura K, Hyon SH. Polyampholytes as low toxic efficient cryoprotective agents with antifreeze protein properties. Biomaterials. 2009;3:4842–4849. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2009.05.025.
22. Congdon T, Notman R, Gibson M. Antifreeze (glyco) protein mimitic behavior of poly (vinyl alcohol): detailed structure ice recrystallization inhibition activity study. Biomacromalecules. 2013;14:1578–1586. DOI: https://doi.org/10.1021/bm400217j
23. Weng L, Swei А, Toner М. Role synthetic antifreeze agents in catalyzing ice nucleation. Cryobiology. 2018;84:91–94. DOI: https://doi.org/10.1016/j. cryobiol.2018.08.010.
24. Bercea M, Morariu S, Rusu D. In situ gelation of aqueous solutions of entangled poly(vinylalcohol). Soft Matter. 2013;9:1244–1253.
25. Hvozdiuk YaV, Chekanova VV, Pakhomova YuS, Kompaniyets AM. Fizyko-khimichni vlastyvosti ta kriozakhysna diya rozhyniv polivinilovoho spyrtu, hlitserynu ta seredovyshch na ocnovi yikh kombinatsiy pry zamorozhuvanni erytrotsytiv. Problemy kriobiolohiyi I kriomedytsyny. 2020;30(3):288. DOI: https://doi.org/10.15407/cryo30.03a.288. [in Ukrainian].
26. Hvozdiuk YaV, Pakhomova YuS, Chekanova VV, Kompanіets AM. Kriozakhysna diya kriokonservantiv na osnvi 1,2-PD ta polivinilovoho spyrtu (m. m. 9 kDa) pry povil’nomy okholodzhenni erytrotsytiv lyudyny. Scientific collection «Interconf». 2021;48:783–785. [in Ukrainian].
27. Hvozdiuk YaV, Dyubko TS, Kompanіets AM. Vplyv zamorozhuvanya-vidihrivu pid zakhystom polivinilovoho spyrtu (m. m. 9 kDa) na bilky erytrotsytiv. Scientific collection «Interconf». 2021;65:128–132. [in Ukrainian].
28. Liu S, Wang W, von Moos E. In vitro studies of antifreeze glycoprotein (AFGP) and a C-linked AFGP analogue. Biomacromolecules. 2007;8:1456–1462. DOI: https://doi.org/10.1021/bm061044o.
29. Gibson MJ. Slowing the growth of ice with synthetic macromolecules beyond antifreeze (glyco)proteins. Polym. Chem. 2010;1:1141–1152.
30. Huggins CE. Prevention of hemolysis volumes of red blood cells slowly frozen and thawed in the presence of dimethylsulfoxide. Transfusion. 1963;31:483–493.

«Вістник проблем біології і медицини» Випуск 2 Том 1 (164), 2022 рік , 89-99 сторінки, код УДК 641.528+661.188.1+678.746+547.42+612.111

10.29254/2077-4214-2022-2-1-164-89-99